Bio-Rad_iCycleriQ熒光定量PCR儀是分子生物學實驗室的常用設備，其精準的溫度控制和靈敏的光學檢測系統(tǒng)為基因表達分析、SNP分型等研究提供了可靠保障。要充分發(fā)揮這臺儀器的性能，需要掌握一些關(guān)鍵的操作技巧。
在實驗準備階段，耗材的選擇至關(guān)重要。推薦使用低吸附的PCR管或96孔板，并確保管蓋閉合。反應體系的配制需要在冰上進行，各組分要充分混勻。引物和探針的濃度需要優(yōu)化，通常引物終濃度為0.2-0.5μM，探針終濃度為0.1-0.2μM。模板DNA的加入量建議在1-100ng之間，過高可能導致擴增效率下降。
程序設置是實驗成功的關(guān)鍵。退火溫度需要根據(jù)引物的Tm值確定，通常比Tm低3-5℃。延伸時間根據(jù)擴增片段長度設置，一般按每分鐘延伸1kb計算。建議設置熔解曲線分析步驟，以驗證擴增特異性。對于多重PCR，需要仔細優(yōu)化各通道的熒光采集溫度，避免信號干擾。
數(shù)據(jù)分析時，要正確設置基線范圍和閾值線。基線通常選擇3-15個循環(huán)，閾值線設置在指數(shù)擴增期的線性范圍內(nèi)。對于相對定量，需要選擇合適的內(nèi)參基因，并使用ΔΔCt法計算目標基因的相對表達量。絕對定量則需要建立標準曲線，確保擴增效率在90%-110%之間。
儀器維護不容忽視。每月清潔樣品槽和光學系統(tǒng)，使用無水乙醇擦拭樣品槽，用鏡頭紙清潔光學元件。每季度校準溫度控制系統(tǒng)，使用專用校準試劑盒驗證各孔溫度準確性。每年進行全面的光學系統(tǒng)校準，確保熒光檢測的靈敏度和準確性。
掌握這些操作技巧，就能充分發(fā)揮Bio-Rad_iCycleriQ熒光定量PCR儀的性能，獲得可靠的實驗數(shù)據(jù)。隨著使用經(jīng)驗的積累，實驗人員還能根據(jù)具體研究需求，開發(fā)出更優(yōu)化的實驗方案。
